雖然不依賴培養(yǎng)的方法在表征微生物進(jìn)化和生態(tài)方面取得了重大進(jìn)展，但分離物對(duì)于強(qiáng)大的功能研究和可靠的應(yīng)用仍然是不可或缺的。盡管如此，這個(gè)被稱為“大板塊數(shù)異常”的謎題持續(xù)了一個(gè)多世紀(jì)。在典型的環(huán)境樣品中，通常通過顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的細(xì)胞總數(shù)與瓊脂板上的集落形成單位（CFUs）之間的差異相差幾個(gè)數(shù)量級(jí)。用最可能的計(jì)數(shù)方法在液體培養(yǎng)基中獲得了相似或更高比例的可培養(yǎng)細(xì)胞。結(jié)果，相當(dāng)大比例的環(huán)境原核生物被認(rèn)為是未培養(yǎng)或無法在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)的，包括那些被稱為“微生物暗物質(zhì)”或候選分支的生物，這些生物譜系缺乏任何具有代表性的高分類等級(jí)分離物。一個(gè)普遍的誤解是可培養(yǎng)細(xì)胞的比例（PCC）和可培養(yǎng)分類群的比例（PCT）之間的混淆。幾乎所有以前的研究都是測(cè)量PCC，而不是關(guān)注可培養(yǎng)分類群（如物種）相對(duì)于接種物中存在的總分類群的比例。為了準(zhǔn)確評(píng)估可栽培多樣性，必須利用馬丁尼提出的PCT。還基于16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了PCT估計(jì)，引起了人們對(duì)分類群可培養(yǎng)性可能被低估的擔(dān)憂。然而，隨后的討論認(rèn)為，這一結(jié)論是基于一個(gè)固有偏見的概念。它進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)，除非在一定條件下成功培養(yǎng)，否則不可能確定微生物的可培養(yǎng)性。

造成環(huán)境微生物可培養(yǎng)性低的主要因素已被廣泛記錄，包括不利條件（例如，非最佳理化條件，活性氧的存在和某些生長(zhǎng)因子的缺乏），休眠，許多物種的稀有性和其他限制。為了提高可耕性，采用了多種策略，如原位栽培、栽培組學(xué)和創(chuàng)新裝置的使用。其中，培養(yǎng)組學(xué)方法尤為突出。它涉及在多種培養(yǎng)條件下使用易于使用的瓊脂板來擴(kuò)大可培養(yǎng)的多樣性，以及快速的分類方法（例如，質(zhì)譜和16S rRNA測(cè)序）。這種方法導(dǎo)致從人類腸道微生物組中發(fā)現(xiàn)了許多新的分類群。然而，在時(shí)間和成本方面，詳盡地挑選和識(shí)別所有菌落通常是不切實(shí)際的，特別是在處理多個(gè)樣品和各種培養(yǎng)條件下的數(shù)百甚至數(shù)千個(gè)瓊脂板時(shí)。此外，據(jù)報(bào)道，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)過程中可以形成肉眼看不見的微菌落。雖然這些微菌落是可培養(yǎng)的，但它們?cè)诜蛛x過程中很可能被忽視。報(bào)道了一種具有成本效益的平板測(cè)序方法，用于對(duì)生長(zhǎng)在瓊脂平板上的所有可培養(yǎng)類群進(jìn)行分類分析并指導(dǎo)分離。然而，由于樣本范圍和培養(yǎng)條件的限制，研究未發(fā)現(xiàn)具有較高分類等級(jí)的新分類群。

研究中同時(shí)測(cè)量PCT和PCC的圖解（圖源自Nature Communications ）

培養(yǎng)未培養(yǎng)微生物類群的另一種策略是根據(jù)它們的基因組預(yù)測(cè)它們的代謝特征。這種方法利用了通過培養(yǎng)獨(dú)立的高通量測(cè)序方法獲得的豐富的基因組數(shù)據(jù)。然而，傳統(tǒng)的代謝重新建立可能無法指導(dǎo)分離實(shí)驗(yàn)證實(shí)在標(biāo)準(zhǔn)條件下不可培養(yǎng)的分類群（即在脅迫誘導(dǎo)條件下故意抑制其他可培養(yǎng)分類群，如在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加抗生素）。據(jù)所知，這一策略的成功案例很少。研究認(rèn)為，在特定的培養(yǎng)條件下，可培養(yǎng)、不可培養(yǎng)的結(jié)果可以被視為一種表型，可以通過基因組挖掘策略將其與基因型聯(lián)系起來。隨后，這些基因型可能為這些分類群的基本培養(yǎng)條件提供見解。

研究著手通過實(shí)驗(yàn)確定兩種環(huán)境樣品的PCT和PCC：土壤和活性污泥（AS），其中含有高度可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的細(xì)菌多樣性。研究采用了一種簡(jiǎn)化的培養(yǎng)方法，強(qiáng)調(diào)氧氣的可用性（即有氧、厭氧和微嗜氧條件，分別縮寫為AE、AN和MI）和兩種培養(yǎng)基（普通實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基和相應(yīng)環(huán)境樣品的提取培養(yǎng)基，后者被證明在環(huán)境細(xì)菌培養(yǎng)中具有優(yōu)勢(shì)）來描述可培養(yǎng)、不可培養(yǎng)的細(xì)菌分類群。雖然不是所有的條件都測(cè)試了所有的樣本。收集生長(zhǎng)在瓊脂板上的細(xì)胞，并進(jìn)行高通量測(cè)序以進(jìn)行分類和基因組分析。PCT計(jì)算為瓊脂平板上檢測(cè)到的擴(kuò)增子序列變異（ASVs，作為分類標(biāo)記）與接種物中擴(kuò)增子序列變異的比值。研究的兩個(gè)主要目的是：(1)比較PCC和PCT，從而推斷之前對(duì)環(huán)境細(xì)菌可培養(yǎng)性評(píng)估的潛在偏差；(2)參照細(xì)菌可培養(yǎng)表型，提高可培養(yǎng)性。對(duì)于后者，研究人員采取了兩種可能的策略：一種是在特定培養(yǎng)條件下對(duì)可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行綜合分析，以便從特定樣品中有針對(duì)性地分離出高分類水平的新分類群；另一種是利用特定細(xì)菌譜系中可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)分類群之間的比較基因組學(xué)來探索改善培養(yǎng)條件和加強(qiáng)不可培養(yǎng)分類群培養(yǎng)的線索。

參考消息：

https://www.nature.com/articles/s41467-024-53446-4